Понедельник, 25.06.2018, 16:28
Приветствую Вас Гость | RSS

Сайт Издательство

Статистика

Рейтинг@Mail.ru
создание сайтов недорого
Форма входа

Каталог статей

Главная » Статьи » Физика [ Добавить статью ]

ПУРИНЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СЕРДЦА КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ
Список используемых сокращений
АХ – ацетилхолин
АДФ – аденозин
5'-дифосфорная кислота
АМФ – аденозин 5'-монофосфорная кислота
АТФ – аденозин 5'-трифосфорная кислота исх – исходное значение показателя
НА – норадреналин
КХ-карбахолин
цАМФ – циклический аденозинмонофосфат
цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат
ИФ3-инозитотрифосфат
ФЛС-фосфолипаза
С n – количество животных
PPADS – пиридоксальфосфат-6-азофенил-24-дисульфоновая кислота
Rb-2- реактив голубой-2
TNP-ATP-(2`, 3`-о-(2,4,6-тринитрофенил) аденозин-5`-трифосфат β, γ-мАТФ - бета, гамма-метеленаденозин 5'-трифосфорная кислота
2-мАТФ–2-метилтио-аденозин 5'-трифосфорная кислота
М – моль мин – минута мл – миллилитр рис. – рисунок
РНК – рибонуклеиновая кислота с - секунда сут.-сутки табл. –
таблица Введение Кроме хорошо известной роли аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) как внутриклеточного энергетического субстрата известно, что АТФ может регулировать многие внутриклеточные процессы через специфические Р2-пуриноцепторы. За последние три десятилетия накопился обширный фактический материал, свидетельствующий о важной роли АТФ в межклеточных взаимодействиях. Трудно найти клетку, в которой нет рецепторов для внеклеточной АТФ. А разнообразие и количество этих рецепторов превышает все известные подтипы рецепторов для «классических» нейромедиаторов и гормонов. Одним из объектов, в котором пуриновые соединения могут играть важную роль является сердце.
    В литературе имеются убедительные данные о хронотропных, инотропных и аритмогенных воздействиях АТФ на сердце.. Иммуногистохимический анализ тканей сердца показал широкое распространение чувствительных к внеклеточной АТФ Р2-рецепторов на сарколемме проводящих и сократительных кардиомиоцитах (T.Webb et al., 1996; M.Hansen et al., 1999). В сердце крысы обнаружены ионотропные Р2Х1,2,4,5 и метаботропные Р2У1,2,4,6,11 - подтипы пуринорецепторов (G.Vassort, 2001). Интерес к изучению влияния АТФ на деятельность сердца основывается на различных, нередко противоположных результатах. По-прежнему остается нерешенным вопрос том, какое именно соединение оказывает эффект на пуринорецепторы сердца: АТФ или продукт ее гидролиза аденозин? Результаты ранее проведенных исследований привели к убеждению, что механизм действия АТФ основан на непрямом эффекте, наступающем в результате гидролиза АТФ до активного аденозина, действующего на собственные Р1-рецепторы (G. Burnstock and P. Meghji, 1983; G. Froldi et al., 1994, 1997; L.Ren et al., 2003). Согласно последним литературным данным вероятность собственного эффекта АТФ высока. Механизмы положительного хронотропного и инотропного влияния экзогенной АТФ при стимуляции Р2-рецепторов представлены в работах Benham et al., 1987; F.Scamps et al., 1990; J.Zheng et al., 1992; A. Qi and Y.Kwan, 1996; M.Pucéat and G.Vassort, 1996; M. Shoda et al., 1997; M.Jaconi et al., 2000; Q.Liu, R.Rosenberg, 2001; Q.Mei, B.Liang, 2001; J.Shen et al., 2007. Действие АТФ может быть реализовано ее прямым влиянием на кардиомиоциты и изменением активности регуляторных каналов сердца. В настоящее время известно, что АТФ находится в везикулах вместе с АХ или НА и участвует в передаче нервных импульсов, выполняя функции котрансмиттера (G.Burnstock et al., 1989, 1999, 2006, 2009; L.Fieber et al., 1991; A.Pelleg et al., 1997). Исследования подтверждают наличие совместной секреции норадреналина, ацетилхолина и АТФ из симпатических и парасимпатических нервов и способность АТФ модулировать нервную передачу в сердце, увеличивая или ослабляя эффекты, производимые классическими медиаторами (S.Ennion 2000; C.Sesti et al., 2002; S.Boehm et al., 2003).

   Показано, что АТФ ингибирует освобождение НА через пресинаптические Р2У-рецепторы и ослабляет положительный инотропный эффект при стимуляции симпатических нервов в предсердиях крыс, (I. Kugelgen et al., 1996; B.Sperlagh et al., 2000; D.McKitrick, 2000). Известно, что внеклеточная АТФ вызывает депрессорные рефлексы и брадикардию сердца за счет стимуляции Р2Х-рецепторов, расположенных на вагусных афферентных волокнах, что имеет важное значение при ишемии и гипоксии сердца (G.Katchanov, 1996; A.Pelleg et al., 1997; Z.Xiang, 1998; J.Xu, 2005). Представление о физиологической роли пуриновых рецепторов будет неполным, если не рассмотреть их взаимоотношения с рецепторами для других нейромедиаторов. В литературе имеются сведения о функциональном взаимодействии пуриновых рецепторов с холинорецепторами (A.Шакирзянова и др., 2005; E.Silinsky, R.Redman, 1996; R.Giniatullin, E.Sokolova, 1998; T.Searl, 1998). Исследования, проведенные на кардиомиоцитах предсердий, показали, что экзогенная АТФ на фоне карбахолина двухфазно изменяет длительность потенциала действия, что подтверждает способность АТФ модулировать эффекты основного медиатора (Y.Hara, H.Nakaya, 1997). Взаимодействие между адренорецепторами и пуринорецепторами в сердце может проявляться и при активации внутриклеточных сигнальных путей (M.Pucéat et al., 1998).


   Согласно гипотезе Д. Бернстока функцию медиатора АТФ начала выполнять еще на начальных этапах эволюции, задолго до появления основных медиаторов. АТФ считается одним из наиболее филогенетически древних нейромедиаторов. Подтверждением этой гипотезы является тот факт, что внеклеточный эффект АТФ обнаруживается у бактерий и диатомовых морских водорослей (G.Burnstock, 1996). Возможно, ионотропные Р2Х-рецепторы, обнаруженные у примитивных организмов появились раньше метаботропных Р1 и Р2У-рецепторов (G. Burnstock, A. Yerhratsky, 2009). Известно, что и в онтогенезе пуринорецепторы появляются одними из первых. Рецепторы к внеклеточной АТФ, наряду с М-холинорецепторами являются первыми функционально активными мембранными рецепторами, выявляемыми в период формирования зародыша (J.Liou, 1995; L.Sun et al., 1996; J.Shacher, 1997). На сегодняшний день изучение пуринергической регуляции сердца в онтогенезе затрагивает только неонатальный период развития (T.Webb et al., 1996; Y.Bogdanov et al., 1998; M.Hansen et al., 1999; K.Cheung et al., 2003). Многие аспекты функционирования Р2-рецепторов на важнейших этапах раннего постнатального онтогенеза остаются малоизученными, а постсинаптические эффекты АТФ отличаются в различных тканях и на разных этапах онтогенеза. (G.Vassort, 2001). Правомерно было бы предположить, что на ранних этапах постнатального онтогенеза, в условиях незрелости симпатических и парасимпатических регуляторных влияний на сердце, его рецепторного аппарата, возможны разные механизмы влияния АТФ на эффекты основных медиаторов и модулирующее влияние АТФ зависит от этапов биологического созревания организма.

Положения, выносимые на защиту:
  1. АТФ и ее стойкие аналоги повышают сократимость миокарда и частоту сердечных сокращений у крыс 14-100 – суточного возраста за счет активации Р2Х1-рецепторов.
 
  2. На ранних этапах постнатального онтогенеза наблюдается гетерохронное проявление функциональной активности разных подтипов Р2Х-рецепторов в предсердиях и желудочках сердца крыс. Роль Р2Х-рецепторов в положительном инотропном эффекте от 14- к 100-суточному возрасту в предсердиях снижается, а в желудочках возрастает.

  3. Чувствительность сердца к агонистам Р2-пуриноцепторов от 14- к 100-суточному возрасту снижается.

  4. Стойкие аналоги АТФ модулируют адренергическую и холинергическую регуляцию сократимости миокарда разнонаправленно на разных этапах раннего постнатального онтогенеза крыс.

  Научная новизна В работе впервые показано, что все используемые агонисты Р2-пуриноцепторов: АТФ, ά,β –метиленАТФ, 2–метилтиоАТФ и β,γ-метиленАТФ вызывают дозозависимое увеличение частоты сердечных сокращений и силы сокращения миокарда предсердий и желудочков. Концентрации агонистов, вызывающие положительный инотропный и хронотропный эффект от 14- к 100-суточному возрасту повышаются, что указывает на более высокую чувствительность миокарда к агонистам Р2Х- рецепторов на ранних этапах постнатального онтогенеза, это 14- и 21- суточные животные. Использование селективного агониста и блокатора пуриноцепторов β, γ-метиленАТФ и TNP АТФ позволило установить подтип Р2Х-рецепторов, участвующих в повышении частоты сердечных сокращений и силы сокращения миокарда. Доказано, что в реализации положительного хронотропного и инотропного эффекта принимают участие Р2Х1-рецепторы. Впервые показаны возрастные особенности реакции сократимости миокарда на стимуляцию агонистами Р2-пуринорецепторов. Максимальная реакция силы сокращения миокарда на 2–метилтиоАТФ и β,γ-метиленАТФ наблюдается у 21- и 14-суточных крысят достоверно снижаясь к 100-суточному возрасту. Проведенные серии экспериментов с использованием разнообразных агонистов и блокаторов позволили получить новые данные о возрастных особенностях реакции различных подтипов Р2-рецепторов в регуляции сократимости миокарда в постнатальном онтогенезе. Впервые показано гетерохронное проявление функциональной активности разных подтипов Р2Х - рецепторов в предсердиях и желудочках крыс в раннем постнатальном онтогенезе. Роль Р2Х - рецепторов в увеличении силы и длительности сокращения в предсердиях от 14- к 100-суточному возрасту снижается, а в желудочках возрастает. Участие Р2Х4 -рецепторов в повышении сократимости миокарда желудочков на ранних этапах онтогенеза незначительно и проявляется только у 100-суточных крыс.


  При изучении совместного влияния 2-метилтиоАТФ, карбахолина и изопротеренола выявлено, что АТФ модулирует адренергическую и холинергическую регуляцию сократимости миокарда разнонаправлено на разных этапах раннего постнатального онтогенеза крыс. У крыс 21- и 56- суточного возраста совместное действие агонистов β – адренорецепторов изопротеренола и Р2Х-рецепторов 2-метилтиоАТФ приводит к развитию однонаправленного, аддитивного эффекта в увеличении сократимости миокарда. Эффект совместного влияния агонистов Р2-рецепторов 2-метилтиоАТФ и М2-холинорецепторов карбахолина на сократимость миокарда может быть усиливающим или ингибирующим в зависимости от возраста крыс. У 21-суточных крысят 2-метилтиоАТФ снижает угнетающий эффект КХ на сократимость миокарда предсердий и желудочков и усиливает у 14-суточных. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты значительно расширяют представление о физиологической роли внеклеточной АТФ, участии разных подтипов Р2Х-рецепторов в сердечной деятельности крыс в раннем постнатальном онтогенезе. Результаты проведенного исследования углубляют имеющиеся на настоящее время сведения о роли АТФ в качестве модулятора эффектов классических медиаторов на ранних этапах постнатального онтогенеза крыс, в условиях незрелости регуляторных симпатических и парасимпатических влияний на сердце. Материалы исследований заслуживают внимания со стороны специалистов по возрастной и нормальной физиологии и кардиологии.

  Апробация работы Материалы исследований доложены на Всероссийской научной конференции «Физиология сердца» (Казань, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); ХХ Съезде Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); VII Всероссийском научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке», (Казань, 2006); Всероссийской конференции по физиологии кровообращения, ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2008); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2006, 2008); на заседании Татарского отделения Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2009); Международной конференции «Физиология развития человека» Института возрастной физиологии РАО (Москва, 2009); на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета (2005-2008), на заседаниях кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека ТГГПУ (Казань, 2005-2009). Основное содержание работы отражено в 32 работах. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 287 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания организации и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 48 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 511 источников, из них 115 отечественных и 396 зарубежных авторов. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Общие сведения об АТФ Аденозинтрифосфорная кислота хорошо известна как основной поставщик энергии для клеточной активности. Энергия, запасенная в высокоэнергетических связях молекулы АТФ необходима для большого числа внутриклеточных процессов, таких как движение клетки, секреция гормонов или нейромедиаторов, сокращение мышц, деление клетки. АТФ обеспечивает протекание процессов фотосинтеза, клеточного дыхания, фосфорилирования различных белков и много другого. АТФ является одним из мономеров, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот, а также донором фосфатных групп для молекул системы вторичных посредников, например, протеин-киназ (Champe et al., 2004).

  За исследования механизмов синтеза и метаболизма АТФ были присуждены две Нобелевские премии по химии в 1978 (P. Mitchell) и в 1997 (Paul et al.) годах. Рис.1. Структурная формула АТФ Скорость обмена АТФ в сердце очень высока. Работа кардиомиоцита обеспечивается энергией, образуемой главным образом в митохондриях, где происходит окисление различных субстратов: глюкозы, молочной кислоты или свободных жирных кислот. Образующиеся молекулы АТФ расходуются в основном для сокращения миофибрилл, что составляет 80% от всего АТФ, вырабатываемого в кардиомиоцитах. Еще 10-15% АТФ уходит для обеспечения работы мембранных насосов: это кальциевая АТФаза и Nа+/К+-АТФаза сарколеммы. Примерно 5% АТФ используется на обеспечение энергией синтетических процессов (В. Капелько, 2007). Следует отметить, что АТФ необходима для поддержания в закрытом состоянии АТФ-зависимых калиевых каналов. Транспорт молекул АТФ из митохондрий в цитоплазму затруднен из-за большого количества в ней АТФаз. Американский биохимик С.Бессман предложил креатинфосфатный путь транспорта АТФ, который получил подтверждение и в Российском кардиологическом центре (В. Капелько, 2007).

  Изофермент креатинфосфокиназа (КФК) в митохондриях преобразует синтезированный АТФ в креатинфосфат. Эта молекула, имеющая меньшие размеры, чем АТФ, транспортируется к миофибриллам. Здесь другой изофермент КФК вновь отделяет фосфатную группу, переносит ее на АТФазу миозина, а освобожденный креатин возвращается обратно, как челнок. Этот путь эффективнее, требует меньше энергии, а креатинфосфат в цитоплазме не подвергается превращениям, потому что изоферменты находятся только в митохондриях и миофибриллах. О кардиоваскулярных эффектах аденозина известно с конца 20-х годов ХХ века. В 1929 году Drury и Szent-Gyorgy описали влияние адениновых соединений на сердце млекопитающих. Авторы впервые установили, что АТФ и ее метаболиты, вводимые внутривенно, приводят к снижению частоты сердечных сокращений, падению артериального давления и дилатации коронарных сосудов (A.Drury et al., 1929). В дальнейшем появился целый ряд исследований, посвященных влиянию пуриновых соединений на сердечно-сосудистую систему. В 50-ые годы АТФ впервые используется в клинической практике для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы у пожилых людей. Кроме хорошо известной роли пуриновых соединений в метаболизме за последние два десятилетия накопился большой фактический материал, свидетельствующий о важной роли пуринов в межклеточных взаимодействиях. В 60-ые годы прошлого века было убедительно показано, что во многих висцеральных тканях наблюдаются нейрогенные ответы, которые не блокируются адрено - и холинергическими блокаторами (G. Burnstock, 1969).

  В начале 70-годов Д. Бэрнсток и его сотрудники установили, что АТФ выделяется из нервных окончаний, не относящихся ни к адренергическим, ни к холинергическим. Вскоре было установлено, что эти ответы опосредуются пуриновыми соединениями, преимущественно АТФ и аденозином. Поэтому исследуемые не-адренергические, не-холинергические нервы были названы «пуринергическими», а рецепторы, на которые воздействует АТФ и ее производные - пуринорецепторами (G. Burnstock, 1972). Установлено, что ряд физиологических и патофизиологических реакций приводит к высвобождению клетками пуриновых соединений, преимущественно АТФ и аденозина, которые способны взаимодействовать со специальными рецепторами для них – пуринорецепторами (M. Abbracchio, G. Burnstock, 1994, V. Relavic, 1998, Nort, 2002). «Пурины» - это большой класс органических соединений, содержащих два гетерочленных цикла. К пуринам относятся аденозин, гуанин, мочевая кислота, ксантины и многие другие соединения. Пуриновые соединения синтезируются в организме в результате сложного многостадийного процесса с участием рибозо-5-фосфата, глутамина, аспартата и других промежуточных продуктов. Присоединение к ядру пуриновых оснований рибозы приводит к образованию нуклеозидов – аденозина и гуанозина. Фосфорилирование гидроксильной группы рибозы в положение 5' (то есть присоединение остатков фосфорной кислоты) приводит к образованию соответствующих нуклеотидов (А.Зиганшин, 2005).

  Не все агонисты пуринорецепторов относятся к пуринам, так, нуклеотиды с пиримидиновым основанием, например УТФ, могут выступать в качестве нейротрансмиттеров пуринергических нервов (O’Connor et al., 1991). В 70-ые годы профессор Д Бернсток объединил все имеющиеся на тот момент данные о медиаторных свойствах АТФ и аденозина в классическом обзоре «Пуринергические нервы» (G. Burnstock, 1972). В конце 80-х годов обнаружили, что при действии экзогенной АТФ на гладкие мышцы или нейроны возникает ионный ток, приводящей к возбуждению клетки. С этого момента продолжается интенсивное изучение биологической активности и физиологической роли АТФ и аденозина. Было установлено, что АТФ и аденозин могут выделяться различными клетками, в первую очередь нервными (White, 1984; Zimmermann, 1994). АТФ является котрансмиттером сопровождая ряд классических нейромедиаторов и выделяется при активации пресинаптической мембраны в синаптическую щель (E. Silinsky, R. Redman, 1996). Пуринергические синапсы описаны во многих органах и тканях. Также было зарегистрировано высвобождение АТФ и аденозина из клеток сердечной и скелетной мышцы (T.Forrester, 1990; T.Katsuragi et. al., 1993), из гладкомышечных клеток (K.Shinozuka et al., 1994; V.Ralevic, G.Burnsotck, 1998), из клеток эндотелия (J.Pearson et al., 1989), тучных клеток и клеток крови (J.Gordon, 1986).

  Более того, было установлено, что цитоплазматическая мембрана клеток практически всех исследованных тканей содержит специальные рецепторы, чувствительные к пуринам – пуринорецепторы. Посредством воздействия на эти рецепторы АТФ и аденозин могут регулировать многие внутриклеточные процессы (M.Abbracchio et al., 1994; G.Burnstock et al., 1996). В большинстве случаев АТФ выступает в роли комедиатора, например, в симпатических нервах она выделяется наряду с норадреналином и нейропептидом Y, в парасимпатических - вместе с ацетилхолином и вазоинтестинальным пептидом (G.Burnstock, 2004). Одно из первых предположений о модулирующей роли АТФ и родственных соединений для холинергической передачи в сердце было высказано Т.М. Турпаевым в 1965 году. 1.2. Классификация пуринорецепторов Эффекты АТФ и продуктов ее гидролиза опосредуются пуринергическими рецепторами – пуринорецепторами. Сейчас трудно найти клетку живого организма, в которой нет рецепторов для внеклеточной АТФ. Разнообразие их велико – оно превышает все подтипы рецепторов для классических гормонов и нейромедиаторов, т.е. АТФ может вызывать самые разные сигналы в зависимости от того, с каким рецептором она свяжется. Согласно современной классификации Номенклатурного комитета Международного фармакологического общества (G.Burnstock et al., 1996; Fredholm et al., 1997) все пуринорецепторы делятся на две большие группы: Р1- и Р2-пуринорецепторы, каждая из которых включает в себя еще несколько подгрупп (В. Fredholm et al., 1997). ПУРИНОРЕЦЕПТОРЫ Р1-РЕЦЕПТОРЫ Р2-РЕЦЕПТОРЫ А1 А2A A2B А3 Р2X Р2Y P2X1-P2X7 P2Y1-P2Y14 Рис. 2. Классификация пуринорецепторов Еще в 1978 G. Burnstock предложил критерии для подразделения пуринорецепторов на два основных класса – Р1- и Р2-пуринорецепторы. Р1-пуринорецепторы характеризуются большей чувствительностью к аденозину и АМФ, чем АТФ и АДФ (А. Зиганшин и др., 1999).

  Аденозиновые рецепторы (Р1) были подразделены на четыре подтипа: А1, А2А, А2В и А3. Это разделение основывалось на определении молекулярной структуры, распространения в тканях и фармакологическом профиле рецепторов. Все идентифицированные до сих пор Р1 рецепторы являются G – протеин зависимыми (А.У. Зиганшин и др., 1999; V. Ralevic et al., 1998). В качестве вторичных посредников этих рецепторов выступают цАМФ и инозитолтрифосфат Рецепторы АТФ обозначаются как Р2-рецепторы. Они делятся на два семейства: Р2Х и Р2У-пуриноцепторы (М. Abbracchio; G. Burnstock, 1995). В основе классификации лежат фармакологические доказательства: тип ответа, порядок активности агонистов, разная степень десенситизации, вызываемая АТФ и ее структурными аналогами. Для Р2Х - пуринорецепторов наиболее активным агонистом является АТФ, а для Р2У - 2 - метилтиоАТФ и УТФ (А.У. Зиганшин и др., 1999). Порядок активности агонистов может зависеть от скорости их гидролиза до неактивных соединений, и значительно различаться в зависимости от вида ткани. Более четким доказательством для подразделения Р2 рецепторов на подтипы служит наличие селективных блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для Р2Х-, так и Р2У - рецепторов. Для Р2Х - рецепторов - α,β-метилен АТФ, который обладает десенситизирующим действием, пиридоксальфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфоновая кислота (PPADS) и другие; для Р2У пуринорецепторов - реактив голубой 2 (А. Зиганшин и др., 1999). В каждом из этих семейств выделяют несколько подтипов рецепторов, обозначаемых соответствующими цифрами.

  Эти цифры присваиваются только после определения молекулярной структуры рецепторов и их клонирования. В настоящее время описано 7 подтипов Р2Х рецепторов (Р2Х1-Р2Х7), сюда же были отнесены Р2Z рецепторы, а так же 6 подтипов Р2У рецепторов (Р2У1, Р2У2, Р2У3, Р2У4, Р2У6, Р2У11), с включением бывших Р2Т, Р2U и Р2D рецепторов (А. Зиганшин и др., 1999). В 1986 E. Gordon предложил выделить из класса Р2 пуринорецепторов еще два подтипа Р2Т и Р2Z. Первый рецептор располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в отличие от всех остальных подтипов P2 - пуринорецепторов, активируется АДФ и блокируется АТФ. Р2Z - рецепторы расположены в тучных клетках. В 1991 S. O’Connor предложил так называемый нуклеотидный рецептор одинаково чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но не чувствительный к 2 – метилтиоATP и α,β-метилен АТФ. Этот рецептор получил обозначение Р2U. Возможным антагонистом данного рецептора является сурамин. Существует еще один подтип Р2-пуринорецепторов - Р2D, преимущественными агонистами для них являются адениновые динуклеотиды. Адениновые динуклеотиды значительно более устойчивы к энзиматическому распаду, чем АТФ и поэтому их действие может проявляться дольше (А. Зиганшин и др., 1999). В настоящее время Р2-рецепторы клонированы и экспрессированы в различных клеточных системах; известна их структура, которая отличается от аналогичных по функции рецепторов для классических нейромедиаторов. 1.3. Общая характеристика Р2-пуринорецепторов Р2Х - рецепторы – это белковые комплексы, состоящие из 379-472 аминокислот, встроенных в мембрану в форме поры, охватывающей два гидрофобных трансмембранных домена с большой внеклеточной гидрофильной петлей (V. Ralevic et al., 1998; G. Vassort, 2001). Большая часть молекулы этого белка находится внеклеточно, образуя большую петлю, при том, что оба концевых фрагмента располагаются внутри клетки. Оба концевых фрагмента располагаются внутри клетки. Подтипы рецепторов в основном отличаются по длине С-концевого фрагмента молекулы белка (P. Dunn et al., 2001).

  Изучение рецепторов проводится при идентификации их с помощью специфических маркёров (например, иммунофлюоресцирующих антител) или в исследовании эффектов, которые они опосредуют в тканях. Особый интерес представляет определение функциональной активности рецепторов поскольку в организме они могут находиться в функционально активном или неактивном состояниях. Следует отметить, что кроме описанных в классификации мономерных подтипов Р2-рецепторов в организме человека и животных присутствуют также комбинации из различных подтипов Р2X рецепторов. Установлено, что Р2X рецепторы способны образовывать как гомомультимерные рецепторы, состоящие из нескольких одинаковых подтипов Р2-рецепторов, так и гетеромультимерные рецепторы, субъединицы которых представлены различными подтипами одного класса рецепторов. Объединяясь, они могут создавать ионные каналы со свойствами, отличающимися от свойств этих молекул в отдельности. Таким образом, фенотип рецепторов меняется, и чувствительность к используемым агонистам также может стать другой. (К.Radford et al., 1997; К.Le et al., 1998). Фармакологическая характеристика рекомбинантных рецепторов отличается от таковой у нативных рецепторов. Возможно, это обусловлено тем, что в тканях, где есть пуриноцепторы, имеется эктоэнзиматическая система разрушения внеклеточных пуринов и пиримидинов, что часто не учитывается при работе с рекомбинантными рецепторами. Также следует учитывать, что в большинстве случаев ионный транспорт в физиологических условиях обеспечивается не одной, а тремя или более субъединицами Р2Х - рецептора, в комплексе образующих ионный канал. Например, описаны гетеромультимеры, образуемые Р2Х2/3 или Р2Х4/6 - пуриноцепторами. Не исключено, что в физиологических условиях в тканях имеются структурно неполноценные рецепторы, не имеющие собственной функциональной активности, однако способные модулировать эффекты полноценных Р2Х - рецепторов.

  Существование возможных вариантов гетеро - и гомомультимеров, образованных Р2Х-пуринорецепторами подробно рассматриваются в таблице 1 (A. North, 2002). аблица 1 Варианты нативных мультимерных пуринорецепторов, образованных Р2Х субъединицами Р2Х1 Р2Х 2 Р2Х3 Р2Х4 Р2Х5 Р2Х6 Р2Х7 Р2Х 1 + + + - + + - Р2Х 2 + + - + + - Р2Х 3 + - + - - Р2Х 4 + + + - Р2Х 5 + + - Р2Х6 - - Р2Х7 + Примечание: "+" – возможный вариант существования мультимера; "-" - существование мультимера невозможно 1) Р2Х1 - рецептор клонирован из мочевого пузыря мыши H. Valera в 1994, а в 1999 этот рецептор клонировал W. Haines из сердца крысы. Присутствие Р2Х1 -рецептора в сердце крысы подтверждается и рядом других исследователей (S.Nori et al., 1998; B.Khakh et al., 2001). Катион-селективные каналы этого рецептора быстро десенситизируются и имеют относительно высокую проницаемость для Са2+ (V.Ralevic et al., 1998; G. Vassort, 2001). Рецептор представлен во всех гладкомышечных органах. Стимуляция Р2Х1 - рецепторов ведет к выраженной сократительной реакции этих органов, а блокада угнетает сократительную активность (А.У. Зиганшин и др., 2002). В гладкой мускулатуре Р2Х1- рецептор является постсинаптическим рецептором, в то время как в нейронах эти рецепторы располагаются как на пост-, так и на пресинаптической мембране. У крыс в условиях сердечной недостаточности в 207 раз увеличивается уровень мРНК Р2Х1 – рецептора (G. Vassort, 2001). 2) Р2Х2 - рецептор впервые клонирован из клеток феохромоцитомы крысы в 1994 H. Brake. Этот рецептор характеризуется минимальным уровнем десенситизации при воздействии АТФ более 10 секунд. В отличие от Р2Х1 - рецептора он характеризуется низкой проницаемостью для Са2+. Матричная РНК для Р2Х2 - рецептора не обнаружена в скелетной мускулатуре и некоторых органах, таких как печень, почки, легкие и селезенка (V. Ralevic et al., 1998). Но Р2Х2 - рецептор присутствует в миокарде (M. Hansen et al., 1999; G. Vassort, 2001). Бивалентные ионы могут блокировать открытие ионного канала Р2Х2 - рецептора.

  Бивалентные ионы проявляют следующую активность ингибирующего эффекта: Mn2+>Mg2+>Са2+>Ва2+. Иммуногистохимический анализ показал наличие этих рецепторов в головном и спинном мозге (V. Ralevic et al., 1998). 3) Р2Х3 - рецептор клонирован Z.-P. Chen et al. из заднего корешка спинного мозга крысы в 1995 г. Эти рецепторы не найдены в симпатических нервах и нервах, иннервирующих кишечник и гладкую мускулатуру. Р2Х3 - рецептор найден в сенсорных нитях тройничного нерва крысы (D. McQueen, 1998) и в сердце человеческого эмбриона (G. Vassort, 2001). У взрослых людей распространение Р2Х3 - рецепторов ограничено сердцем и спинным мозгом. Генетический дефицит Р2Х3 - рецепторов у животных приводит к выраженному снижению болевой чувствительности (А. Зиганшин и др., 2002; V. Ralevic et al., 1998). 4) Р2Х4 - рецептор клонировали из гиппокампа крысы (X. Во et al., 1995) и головного мозга человека (F. Soto et al., 1996). Он отдаленно относится к Р2Х1, Р2Х2 и Р2Х3-рецепторам. Транскрипция Р2Х4 рецепторов выявлена во многих тканях крысы включая кровеносные сосуды и сердце. Это АТФ-активированные катион-селективные каналы, высоко чувствительны к Са2+. Они активируются АТФ>АТФγŜ>2-мАТФ>АДФ. Отличительной особенностью этих рецепторов является их нечувствительность к ныне используемым блокаторам Р2-рецепторов сурамину, РРАDS и реактиву голубому 2. Гомологичность этих рецепторов у человека и крысы составляет 87%. Отличительной особенностью Р2Х4 – рецепторов у крысы является медленно развивающееся снижение чувствительности к агонисту. Р2Х4 матричная РНК обнаружена в головном и спином мозге, легких, эпителии бронхов, тимусе, мочевом пузыре, семенниках и толстом кишечнике, а также коронарных сосудах (А.У. Зиганшин и др., 2002; G. Vassort, 2001; V. Ralevic et al., 1998). 5) Р2Х5 - рецептор впервые клонирован из брюшного ганглия крысы M. Collo в 1996г. Этот рецептор обнаружен в кишечнике, сердце, мочевом пузыре и спинном мозге (А.У. Зиганшин и др., 2002; V. Ralevic et al., 1998). У крыс Р2Х5 - рецептор найден в сердце и мозге (G. Vassort, 2001). 6) Р2Х6 - рецептор впервые клонирован из шейного ганглия крысы M. Collo в 1996 г. Локализован Р2Х6 - рецептор в центральной нервной системе и двигательных нейронах спинного мозга (А.У. Зиганшин и др., 2002; V. Ralevic et al., 1998). Этот подтип отсутствует в сердце. 7) Р2Х7 - рецептор впервые клонирован из макрофагов и мозга крысы и человека, обнаружен в клетках иммунной системы, кожи и поджелудочной железы. Этот подтип рецептора является на сегодняшний день наиболее крупной молекулой из всех известных рецепторов этого семейства. Гомомультимер из 2 или 3 молекул Р2Х7 - рецептора образует большую пору в мембране, проходимую для веществ с молекулярной массой до 900Д. Образование подобных пор отмечено при ишемии, воспалении и является пусковым моментом апоптоза клеток (А.У. Зиганшин и др., 2002; G. Vassort, 2001). Р2Х рецепторы можно подразделить на две большие группы в соответствии с динамикой десенситизации: быстрой – в пределах 100-300 мсек, или медленной или ее отсутствием. Быстро десенситизируюшиеся Р2Х рецепторы активируются АТФ, альфа, бета-метилен - АТФ.

  Они включают в себя рекомбинацию Р2Х1 и Р2Х3 – рецепторов. Возможно, в десенситизации участвует первый или второй гидрофобный домен рецепторов (P.Werner et al, 1996). Все Р2У - рецепторы имеют широкое распространение в тканях. Р2У-пуриноцепторы по механизму действия являются типичными G-протеинзависимыми рецепторами. Белок имеет 7 трансмембранных фрагмента и образует по 3 петли внутриклеточно и внеклеточно. Подтипы различаются в основном трансмембранными фрагментами молекулы. Подтипы семейства Р2Y рецепторов гораздо разнообразнее, чем любое другое известное семейство G-связанных рецепторов. Третья внутриклеточная петля и СООН-терминальный хвост – это два основных сайта, обусловливающих специфичность других G белок - связанных рецепторов, среди Р2Y рецепторов сильно варьируют (G.Vassort, 2001). Время от воздействия агониста и до появления ответа у этих рецепторов длиннее, чем у Р2Х-пуринорецепторов. Это объясняется тем, что для возникновения ответа необходимо время для включения вторичных посредников. Стимулирование Р2У-пуринорецепторов в гладкомышечных тканях вызывает преимущественно ее расслабление (C. Hoyle, 1992). Семейство Р2У рецепторов связано с гетеромерным G-белком, который в свою очередь активирует систему внутриклеточных посредников для модулирования физиологических функций клеток. Все они широко представлены в тканях. Задача разделения подтипов Р2У рецепторов является сложной, поскольку пока не существует селективных антагонистов для выделения подтипов. 1) Р2У1 - рецепторы клонированы из мозга цыпленка (T. Webb et al., 1993).

  В последующем Р2У1 был изолирован из нескольких видов, включая крысу, мышь, быка и человека с широким спектром распределения в тканях, включая сердце. Физиологические характеристики Р2У1 рецептора показали, что только пурины являются активными для этого подтипа рецептора. УТФ и его производные не активны в его отношении. Р2У1 рецептор характеризуется таким порядком потенции агонистов: 2 метилАДФ>2-метилАТФ>АДФ>АТФ. Р2У1 - рецептор широко распространен в эпителиальных клетках, тромбоцитах, иммунных клетках, остеокластах, а так же во многих органах (G. Vassort, 2001). 2) Р2У2 - рецептор клонирован из клеток нейробластомы мыши J. Lustig в 1993. Он находится во многих видах тканей включая сердечную мышцу. Р2У2 - рецептор найден в эпителиальных клетках, иммунных клетках, остеокластах, почечных канальцах (А.У. Зиганшин и др., 2002). Р2У2 связывается с 2-мя классами G-белков для увеличения числа или проводимости эндогенных Са2+-зависимых СL- каналов и опосредует пертусин токсин –чувствительное увеличение входящих – выпрямляющих К+ каналов семейства Кir3.0 (G. Vassort, 2001). 3) Р2У3 - рецепторы клонированы из мозга цыпленка в 1995 Т. Webb et al. Имеет следующий порядок агонистов: УДФ>УТФ>АДФ>АТФ. Это наиболее вероятный птичий аналог Р2У6 рецептора млекопитающих. 4) Р2У4 - рецептор клонирован из плаценты человека Т. Communi в 1996. Этот рецептор найден в эпителиальных клетках и сердце крысы (А.У. Зиганшин и др., 2002; V. Ralevic et al., 1998), а также в симпатических нейронах крысы и эмбриональном сердце человека (G. Vassort, 2001). Недавно r Р2У4 были клонированы. Они обнаруживают 83% идентичности с Р2У4. Профиль их агонистов близок к таковому для нативных Р2У4-рецепторов: АТФ=УТФ>Ар4А>АТФγ S≥2-метилтио-АТФ. Они также сильно активируются ИТФ и УДФ, хотя последний является частичными агонистом. 5) Р2У6 - рецепторы клонированы из гладких мышц аорты крысы М. Chang в 1995. Они находятся в некоторых эпителиальных клетках, плаценте, Т-клетках и тимусе (А.У. Зиганшин и др., 2002; Ralevic V. et al., 1998) и эмбриональном сердце человека. Было показано, что Р2У6 рецепторы активируются наиболее сильно УДФ и более слабо – УТФ, АТФ и АДФ (G. Vassort, 2001). 6) Р2У11- рецепторы клонированы из плаценты человека Т. Communi в 1997 г. Рецепторы локализованы в кишечнике, сердце, селезенке и гранулоцитах. Они показали 33% гомологичности с hР2У1 рецептором, своим ближайшим аналогом и 28% гомологичности с hР2У2.

  Имеет один потенциальный сайт для N-связанного гликолиза и 2 потенциальных сайта для фосфорилирования протеинкиназы С или кальмодулин-зависимой протеинкиназой. НР2У11 позитивно взаимодействует и с фосфоинозитидом, и с аденилатциклазой, что является уникальной особенностью для семейства Р2У-рецепторов (А.У. Зиганшин и др., 2002; G. Vassort, 2001). 7) Р2У12 - рецепторы обнаружены в тромбоцитах (А.У. Зиганшин и др., 2002). 1.3.1. Р2-рецепторы в сердце В литературе имеется достаточно много сведений о роли Р2-рецепторов в различных органах и тканях животных. В частности, было показано наличие функционально-активных Р2-рецепторов в сердечно-сосудистой системе (А.У. Зиганшин и др., 2003; 2004; G. Vassort, 2001; Jiang et al., 2005). В то же время многие аспекты функционирования Р2-рецепторов в организме человека, как в норме, так и при различных заболеваниях остаются малоизученными и требуют дальнейших исследований. В сердечно-сосудистой системе Р2-пуриноцепторы присутствуют на поверхности кардиомиоцитов предсердий, желудочков, проводящей системы сердца, в эндотелии и гладкомышечных клетках стенок сосудов. Проведенный иммуногистохимический анализ тканей сердца крысы (M. Hansen et al., 1999) показал широкое распространение Р2Х2, Р2Х5 подтипов ионотропных Р2-рецепторов на сарколемме кардиомиоцитов, а Р2Х1 и Р2Х3 подтипов вблизи синаптических контактов нейронов с кардиомиоцитами. Исследования микросрезов ткани из разных частей сердца крысы выявили присутствие Р2Х1, Р2Х2, Р2Х4 –пуринорецепторов в предсердии и Р2Х4 - рецепторов в желудочке (G. Vassort, 2001, Табл. 2).
Категория: Физика | Добавил: Гость (21.06.2011)
Просмотров: 1910 | Рейтинг: 0.0/0

Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Поиск